Pregabalina nu este un agonist al receptorilor GABAA sau GABAB.
Pregabalina este un gabapentinoid și acționează prin inhibarea anumitor canale de calciu. În mod specific, este un ligand al situsului subunității auxiliare α2δ al anumitor canale de calciu dependente de tensiune (VDCC) și, prin urmare, acționează ca un inhibitor al VDCC-urilor care conțin subunitatea α2δ. Există două subunități α2δ care leagă medicamentul, α2δ-1 și α2δ-2, iar pregabalinul prezintă o afinitate similară pentru (și, prin urmare, lipsă de selectivitate între) aceste două situsuri. Pregabalina este selectivă în legarea sa de subunitatea α2δ VDCC. În ciuda faptului că pregabalina este un analog GABA, nu se leagă de receptorii GABA, nu se transformă în GABA sau alt agonist al receptorului GABA in vivo și nu modulează direct transportul sau metabolismul GABA. Cu toate acestea, s-a descoperit că pregabalinul produce o creștere dependentă de doză a expresiei cerebrale a decarboxilazei acidului L-glutamic (GAD), enzima responsabilă de sintetizarea GABA și, prin urmare, poate avea unele efecte indirecte GABAergice prin creșterea nivelurilor de GABA în creier. În prezent, nu există dovezi că efectele pregabalinei sunt mediate de orice alt mecanism decât inhibarea VDCC care conțin α2δ. În conformitate, inhibarea VDCC-urilor care conțin α2δ-1 de către pregabalin pare să fie responsabilă pentru efectele sale anticonvulsivante, analgezice și anxiolitice.
α-aminoacizii endogeni L-leucina și L-izoleucina, care seamănă îndeaproape cu pregabalinul și cu ceilalți gabapentinoizi în structura chimică, sunt liganzi aparenti ai subunității α2δ VDCC cu afinitate similară cu gabapentinoidele (de exemplu, IC50 = 71 nM pentru L- izoleucină) și sunt prezente în lichidul cefalorahidian uman la concentrații micromolare (de exemplu, 12,9 μM pentru L-leucină, 4,8 μM pentru L-izoleucină). S-a teoretizat că aceștia pot fi liganzii endogeni ai subunității și că pot antagoniza competitiv efectele gabapentinoidelor. În conformitate, în timp ce gabapentinoizii precum pregabalinul și gabapentina au afinități nanomolare pentru subunitatea α2δ, potențele lor in vivo sunt în intervalul micromolar scăzut, iar competiția pentru legarea L-aminoacizilor endogeni este probabil responsabilă pentru această discrepanță.

Într-un studiu, s-a descoperit că pregabalina posedă afinitate de 6 ori mai mare decât gabapentina pentru VDCC care conțin subunități α2δ. Cu toate acestea, un alt studiu a constatat că pregabalinul și gabapentina au avut afinități similare pentru subunitatea α2δ-1 recombinantă umană (Ki = 32 nM și, respectiv, 40 nM). În orice caz, pregabalinul este de 2 până la 4 ori mai puternic decât gabapentina ca analgezic și, la animale, pare a fi de 3 până la 10 ori mai puternic decât gabapentina ca anticonvulsivant.